Interdiscip Sci. 2009 Jun;1(2):81-90. doi: 10.1007/s12539-009-0036-7. Epub 2009 Mar 4.

Electromagnetic signals are produced by aqueous nanostructures derived from bacterial DNA sequences.

Montagnier L¹, Aïssa J, Ferris S, Montagnier JL, Lavallée C.

Abstract

A novel property of DNA is described: the capacity of some bacterial DNA sequences to induce electromagnetic waves at high aqueous dilutions. It appears to be a resonance phenomenon triggered by the ambient electromagnetic background of very low frequency waves. The genomic DNA of most pathogenic bacteria contains sequences which are able to generate such signals. This opens the way to the development of highly sensitive detection system for chronic bacterial infections in human and animal diseases.

PMID:20640822

 DOI:10.1007/s12539-009-0036-7

سیگنال های الکترومغناطیس توسط نانوساختارهای آبی مشتق شده از سکانس های DNA باکتریائی تولید می شوند

لوک  مونتانیه، جمال آیسا، استفان فریس، ژان-لوک مونتانیه، کلود لاوالی

مترجمین: دکتر وحیده مظاهری، دکتر مریم صالح

خلاصه: ویژگی جدید DNA شرح داده شده است: توانائی برخی از توالی های  DNA باکتریایی منجر به ایجاد امواج الکترومغناطیسی در محلول های  بسیار رقیق می شود. به نظر می رسد پدیده رزونانس توسط امواج با فرکانس بسیار پایین موجود در محیط پس زمینه الکترومغناطیس ایجاد می شود.  DNA ژنومی اکثر باکتری های بیماریزا توالی هائی دارند که قادر به تولید چنین سیگنال هائی می باشند. بدین وسیله مسیر پیشرفت سیستم تشخیص با حساسیت بالا برای عفونت های باکتریایی مزمن در بیماری های انسانی و حیوانی باز می شود.

کلمات کلیدی: DNA ، الکترومغناطیس، سیگنال، باکتری

امروزه میکروارگانیسم های بیماری زا از یکطرف توسط سیستم ایمنی میزبان های خود تحت تأثیر فشار انتخابی بالا قرار می گیرند  و از طرف دیگر باید تحت درمان های  ضد ویروسی و یا آنتی بیوتیکی زنده بمانند. میکروارگانیسم ها بطور شگفت انگیزی در پی یافتن راه های بسیاری برای فرار از این شرایط خصمانه می باشند، مانند جهش های مقاومت، قابلیت بالای تغییر در آنتی ژنهای سطحی، بیو فیلم های محافظتی ، دوره کمون  داخل سلول ها و بافت ها.

مشاهدات ابتداییMontagnier and Lavallee)) نشان میدهد که محصول برخی از روش های فیلتراسیون که با هدف استریل کردن مایعات بیولوژیک انجام میگیرد تحت شرایطی مشخص همان میکروارگانیسم های عفونی هستند که قبل از مرحله فیلتراسیون در محیط حاضر بودند.بنابراین، حاصل فیلتراسیون سوپرناتانت کشت لنفوسیت های انسانی عفونی شده  با مایکوپلاسما پیروم (Mycoplasma pirum )، میکروارگانیسمی با اندازه حدود 300 نانومتر، از طریق منافذ فیلتر 100 و یا20 نانومتری، ظاهرا” مایع استریلی می باشد. با این حال وقتی لنفوسیت های انسانی که از نظر مایکوپلاسما منفی بودند به مدت 2 تا 3 هفته انکوبه شدند، توانستند مایکوپلاسما با منشاء اولیه را مجددا” تولید کنند.

به طور مشابه، یک فیلتراسیون 20 نانومتری، بخش عفونت زای کوچکی از HIV راحفظ نمی کند. HIV عامل ایجادکننده بیماری ایدز، با ذرات ویروسی دارای قطر متوسط 100-120 نانومتر می باشد.

طی بررسی ماهیت چنین فرم های عفونی حاصل از صاف کردن، متوجه ویژگی دیگری از مواد صاف شده شدیم، که ممکن است به ویژگی قبل مرتبط باشد و یا ارتباطی به آن نداشته باشد و آن: توانائی تولید برخی امواج الکترومغناطیسی با فرکانس پایین به شیوه ای تجدید پذیر بعد از رقت هایی مناسب در آب است. انتشار  چنین امواجی به احتمال زیاد نشان دهنده پدیده رزونانس وابسته به تحریک توسط اختلال الکترومغناطیسی محیط می باشد. این حالت  با حضور در رقتهای آبی از نانوساختارهای پلیمری با  اندازه مشخص در ارتباط است. سوپرناتانت سلول های یوکاریوتی غیر عفونی به عنوان گروه شاهد این ویژگی را نشان نمی دهند.

در این مقاله ما اولین خصوصیت سیگنال های الکترومغناطیسی (EMS) و نانو ساختارهای مربوط به آنها را که توسط بعضی باکتری های تخلیص شده، تولید می شود ارائه می کنیم.

علاوه بر مایکوپلاسما پیروم (M. pirum)، یک باکتری کلاسیک تر، مثل E.Coli ، به منظور آنالیز استفاده شد. نانوساختارهای  تولید شده توسط HIV هدف مقاله دیگری خواهد بود.

مایکوپلاسما پیروم(pirum.M) یک سلول باکتریایی کوچک گلابی شکل است، مشابه مایکوپلاسما پنومونیه(M.pneumonia)، که می تواند در محیط غنی سنتز شده (SP4 ) رشد کند (Tully et al، 1977)، البته در سطح لنفوسیت های T انسانی نیز تکثیر می یابد.

سوش Ber)) مورد استفاده در آزمایش های ما از کشت لنفوسیت T خون یک شخص به ظاهر سالم، جدا شد (Grau et  al ، 1993). چسبندگی قوی مایکوپلاسما به لنفوسیت ها با یک چسبندگی خاص که قبلا” توسط نویسندگان کلون و سکانس شده است، میانجی گری می شود (Tham,et al  ، 1994).

به عنوان منبع اصلی مایکوپلاسما، سوپرناتانت کشت لنفوسیت های T انسانی یا کشت تومور CEM از رده سلولی T را استفاده شد. در ابتدا همه کشت های سلولی قبل از شروع آزمایشات برای عدم وجود آلودگی به مایکوپلاسما پیروم به روش مولکولی PCR  و nested PCR تست شدند. تیتر 10⁷ -10⁶ واحد در میلی لیتر عفونت مایکوپلاسما پیروم سریعا” پس از 6-5 روز انکوباسیون به دنبال عفونت عمدی از هر دو نوع کشت به دست آمد.

برای حدف سلول های مایکو پلاسما فیلتراسیون سوپرناتانت شفاف شده، ابتدا بر روی فیلتر های میلی پور 45/0 میکرومتری( 450 نانومتر) برای حذف دبری ها و مواد زائد و متعاقبا” روی فیلتر های میلی پور 1/0 میکرومتری (100 نانومتر)  و یا روی فیلتر های واتمن Whatman  02/0میکرومتر (20نانومتر) انجام شد. جهت اطمینان از استریل بودن بخش های صاف شده از دو فیلتر 100 نانومتری و 20 نانو متری برای چند هفته در محیطSP4  گرماگذاری انجام گرفت. تکرار تحقیقات برای یافتن اثرات ناچیزی از DNA مایکوپلاسما به روش مولکولی PCR  و nested PCR با استفاده از پرایمر های اختصاصی برای ژن چسبندگی و یا ژن ریبوزومی 16S به طور مداوم منفی بود.

هر چند هنگامی که فیلترها به مدت دو هفته ( 100  نانومتر) و به مدت سه هفته ( 20  نانومتر) با  کشت لنفوسیت های T فعال انسانی انکوبه شدند، مایکوپلاسما با تمام ویژگی های اصلی که قبلا” مشاهده شده بود، در محیط کشت به دست آمد.

همان فیلترها درست بعد از فیلتراسیون برای تولید امواج الکترومغناطیسی با فرکانس پایین آنالیز شدند. برای این منظور برای تشخیص سیگنال های تولید شده توسط مولکولهای جدا شده منتسب به فعالیت بیولوژیکی از دستگاهی که  قبلا”  توسط Benveniste و Coll (1996؛ 2003) طراحی شده استفاده می شود. اصول  این فن آوری در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل 1: دستگاه ضبط و تجزیه و تحلیل سیگنال های مغناطیسی (EMS) : (1) سیم پیچ: یک قرقره سیم مسی، امپدانس 300 اهم. (2) لوله پلاستیکی در پوش دار حاوی 1 میلی لیتر از محلول  مورد تجزیه و تحلیل؛ (3) امپلیفایر؛  (4) کامپیوتر با نرم افزار.

به اختصار، فیلتر های 100 نانو متر یا 20 نانومتر به طور سریالی از  رقت 1 در 10 (1/0 +9/0 در آب مقطر (تزریقی)) رقیق شدند. به منظور جلوگیری از رسوب پروتئین نهایی در آب مقطر، 2 رقت اول (10/1 و 100/1) در محیط RPMI بدون سرم تهیه شد.

هر رقت در اپندورف پلاستیکی 5/1میلی لیتری که محکم بسته شده و به مدت 15 ثانیه به شدت ورتکس شده است تهیه گردید. این مرحله برای تولید سیگنال ها حیاتی است.

پس از تهیه همه رقت ها (به طور کلی 15-20 رقت دهدهی)، لوله های در بسته یکی پس از دیگری تک تک بر روی یک سیم پیچ الکترومغناطیس خوانده می شوند و متصل به یک کارت تقویت صدا میباشدکه به یک لپ تاپ ترجیحا” با باتری 12 ولت متصل می باشد. هر موج طی 6 ثانیه دو بار ثبت می شود، 500 بار تشدید می شود و با نرم افزار های مختلف  برای مشاهده سیگنال ها بر روی صفحه نمایش کامپیوتر (شکل 1) پردازش شده است.

هارمونی اصلی سیگنال های پیچیده با استفاده از چند نرم افزار از تبدیل  Fourier آنالیز شدند.

در هر آزمایش، نویز داخلی تولید شده توسط قطعات مختلف سیستم خوانش برای اولین بار ثبت شد (سیم پیچ به تنهایی، سیم پیچ با یک  لوله پر شده با   آب). آنالیز Fourier نشان می دهد (شکل 2 (c، d)) که نویزعمدتا” از فرکانس های بسیار پایین تشکیل شده بود، احتمالا” حداقل در بخشی به وسیله 60/50 هرتز جریان الکتریکی تولید می شود. استفاده از باتری 12 ولتی برای منبع برق کامپیوتر که برای القاء سیگنال رزونانس از نانوساختارهای خاص مورد نیاز است، کاهش داده شد ، اما این نویزحذف نشد.

وقتی فیلتر رقت های مایکوپلاسما پیروم برای انتشار موج ثبت شد، اولین پدیده آشکار بدست آمده افزایش دامنه سیگنال ها در رقت های خاص بر روی نویز پس زمینه (شکل 2 (a)) و همچنین افزایش فرکانس ها(شکل 2 (b)) بود. اگر لوله مورد آنالیز در داخل جعبه ای محاظت شده با ورق هائی از جنس مس و مومتال( ترکیبی از نیکل، آهن و مس) قرار داده شود، این تغییر  حذف می شود  ( (David  ، 1998).

آنالیز Fourier بر روی سیگنال های مایکوپلاسما پیروم نشان داد که به سمت فرکانس های بالا نزدیک به 1000 و مضرب های آن شیفت دارند. پروفایل ها برای همه رقت ها  یکسان بودند و افزایش دامنه را نشان میداد (شکل 2(c) و (d )) .

نخستین دو رقت پایین معمولا ” منفی ، و فقط نشان دهنده نویز پس زمینه بودند. سیگنال های مثبت معمولا” در رقت های مختلف^5- 10تا ^8- 10یا ^12- 10 به دست آمد. رقت های بالا تر دوباره منفی بودند (شکل 3).

رقت های مثبت بر اساس نوع فیلتراسیون متفاوت بودند، به طور کلی فیلتر 20 نانومتری در رقت های بالاتر، نسبت به 100 نانومتری مثبت بودند.

سوسپانسیون اولیه فیلتر نشده در همه رقت ها منفی بود، پدیده ای که برای تمام میکروارگانیسم های مورد مطالعه مشاهده شد.

حجم و تراکم ساختارهای مولد سیگنال در رقت های آبی:

بخشی از فیلتر 20  نانو متر ی بالای گرادیان 5-20% ( وزنی حجمی) سوکروز در آب قرار داده شد و به مدت 2 ساعت در35000 دور در دقیقه در یک روتور نوسانی سانتریفوژ شد. این شرایط قبلا” برای به دست آوردن تعادل دانسیته سلول های مایکوپلاسمای دست نخورده متشکل از یک باند تیز در محدوده 21/1 دانسیته استفاده شده است. بخش های جمع آوری شده از ته لوله ها ، 2 به 2 ترکیب و برای انتشار سیگنال مورد سنجش قرار داده شد.

شکل 4. ساختار های منتشر کننده سیگنال را نشان می دهد که در طیف وسیعی از دانسیته از 15/1 تا 25/1 توزیع می شوند و همچنین  ضریب رسوب بالایی دارند.

شکل 2: تشخیص EMS سوسپانسیون مایکوپلاسما پیروم : چپ: نویز پس زمینه (از سوسپانسیون فیلتر نشده  و یا رقت پائین منفی). راست: سیگنال مثبت (از یک رقت بالا D-7  ( 10-7) .(a) ضبط واقعی (2 ثانیه از یک ضبط 6 ثانیه  ای) بعد از تیمار WaveLab (Steinberg)؛ (b) جزئیات آنالیز سیگنال (مقیاس در میلی ثانیه)؛ (c) نرم افزار آنالیز تبدیل Fourier Matlab 3D ( بعد افقی یاabcissa  :  20-0 کیلو هرتز، بعد عمودی : شدت نسبی، سه بعدی: ضبط در زمان های مختلف)؛ فرکانس ها در رنگ های مختلف قابل رویت هستند؛ (d) Sigview Fourier transform: توجه داشته باشید که هارمونی های جدید در محدوده 3000-1000 هرتز می باشد.

شکل3: ظبط تیپیک سیگنال های  محلول های آبی از مایکوپلاسما پیروم (نرم افزار Matlab): توجه داشته باشید که سیگنال های مثبت از رقت های  D-7 به D-12 می باشد.

شکل 4: سوسپانسیون مایکوپلاسما پیروم بدست آمده از فیلتر 02/0 میکرونی با شیب غلظت سوکروز با دور35000 در دقیقه، بمدت 2 ساعت سانتریفوژ گردید . بخش های جمع آوری شده دو به دو ترکیب شده و تا 15 برابر رقیق شده و برای EMS تست شدند. ستونهای عمودی نشان دهنده بخش های مثبت برای EMS می باشد.

سپس آزمایشات با یک باکتری کلاسیک تر، اشریشیا کلی، با استفاده از سویه آزمایشگاهی K1 انجام شد.

کشت اشریشیا کلی با همزدن محیط و شرایط هوازی حین رشد  و رسیدن محصول به 10⁹ واحد باکتری در میلی لیتر انجام و توسط اسپکترومتری اندازه گیری شد.  سپس سوسپانسیون در 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد، سوپرناتانت با فیلتر 450 نانومتر فیلتر شد و محصول فیلتر دوباره با فیلتر 100 نانومتر فیلتر گردید. فیلتر نهائی زمانی که بر روی محیط مغذی آگار کشت داده شد استریل بود، و همانطور که در بالا برای مایکو پلاسما پیروم توضیح داده شد برای انتشار موج الکترومغناطیسی مورد آنالیز قرار گرفت. سیگنال  رقت های محدوده ^8-10 تا ^12-10 با پروفایل های روی نرم افزار Fourier transformation مشابه با سیگنال مایکو پلاسما پیروم بودند (شکل 5). در یک آزمایش، برخی از رقت های بسیار بالا ، در محدوده ^9-10 تا ^18-10  مثبت شدند. بخشی از سوپرناتانت فیلتر نشده، تا رقت ^38-10 هیچ سیگنالی بالای پس زمینه را نشان نداد که مجددا” اهمیت حیاتی مرحله فیلتراسیون برای تولید سیگنال های خاص را نشان میدهد.

تنها تفاوت با مایکوپلاسما پیروم عدم ظهور سیگنال بعد از فیلتراسیون با فیلتر 20 نانو متری بود این حالت پیشنهاد می دهد که ساختار های وابسته به سیگنال ها با این فیلتر ها حفظ شدند، و بنا براین، سایز بزرگتر از 20 نانو متر و کوچکتر از 100 نانو متر داشتند.

سوال بعدی ما این بود:  چرا رقت های پایین تر، که منطقا” باید حاوی  تعداد زیادی از ساختارهای مولد سیگنال باشند، “silent” بودند. هنگامی که 1/0 میی لیتر از یک رقت کم منفی(به عنوان مثال رقت  ^3- 10 ) را به 4/0 میلی لیتر یا 9/0 میلی لیتر از  یک رقت مثبت (^8-10)  اضافه شد، بعدی منفی شد. این نتیجه نشان می دهد که رقت های کم ” silent” ، احتمالا” با تداخل منابع چندگانه انتشار در همان طول موج و یا کمی خارج از فاز مانند تراکم امواج رادیوئی خود مهار کننده هستند. متناوبا”، فراوانی نانوساختارها می تواند در آب یک ژل تشکیل دهد و در نتیجه مانع از ارتعاش شود.

• شواهدی برای “بحث متقابل” همولوگوس بین رقت ها

سپس تعجب ما از آن بود آیا تولید ساختارهای انتشار سیگنال جدید از لوله ای به لوله ای دیگر با استفاده از انتقال موج، ممکن بود یا خیر. آزمایش بعدی که چندین بار تکرار شد نشان داد که در واقع این مورد بود.

شکل 5: EMS  ازفیلتر 1/0 میکرون اشریشیا کلی. EMS مثبت از رقت D-8 تا D-11: (a) ثبت واقعی؛ (b) آنالیز میلی ثانیه؛ (c) آنالیز Fourier transform نرم افزار Matlab. (d) آنالیز Fourier transform SigView. NF: فیلتر نشده.

لوله دهنده از یک رقت کم “silent” اشریشیا کلی( ^3- 10 ) نزدیک لوله گیرنده از بالاترین رقت مثبت “loud” و پهلو به پهلوی همان آماده سازی (^9-10 ) قرار داده شد. هر دو لوله در یک جعبه مومتال به مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند، به طوری که لوله ها در معرض نویز الکترومغناطیسی خارجی قرار نداشتند، و تنها در معرض سیگنال های تولید شده توسط ساختارهای موجود در خود لوله ها بودند.

سپس لوله ها دوباره توسط دستگاه تشخیص سیگنال خوانده شدند: لوله دهنده هنوز هم “silent” بود، هرچند لوله گیرنده نیز “silent” شد.

علاوه بر این، وقتی رقتهای بیشتر از لوله گیرنده (^10-10،^11- 10، ^12-10) ساخته شد، این رقت ها مثبت شده بود (شکل 6). این نتایج نشان می دهد که لوله گیرنده که با تشکیل بیش از حد نانوساختارهای جدید” silent “شده بود، می تواند سیگنال ها را به رقت بعدی منتشر کند.

شکل 6: تبادل اطلاعات بین رقت ها(از فیلتر 1/0 میکرونی باکتری اشریشیا کلی)، توضیح آن را  در متن مشاهده نمائید.

این اثر با تداخل یک صفحه فلزی مومتال بین دو لوله در طول دوره تماس 24 ساعته سرکوب شد که اشاره به نقش امواج فرکانس پایین در این پدیده را دارد.

همچنین انتشار سیگنال های الکترومغناطیس مشابه از چند گونه دیگر باکتری مشاهده شد از آن جمله می توان به باکتری های زیر اشاره نمود: استرپتوکوک B، استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا، پروتئوس میرابیلیس، باسیلوس سوبتیلیس، سالمونلا، کلستریدیوم پرفرنژنس، که سیگنال  همه آنها در همان محدوده از رقت مشاهده شده برای اشریشیا کلی بود و تنها پس از فیلتراسیون با فیلتر 100 نانو متر ( و  نه با فیلتر 20 نانو متر)  مشاهده شد.

نکته قابل اهمیت اینکه اگر دو لوله یکی silent  و دیگری loud حاوی رقت هایی از گونه یکسان از باکتری باشند انتقال سیگنال بین دو لوله مشاهده می شود. به عبارت دیگر، یک لوله دهنده استافیلوکوک اورئوس تنها می تواند بطور دو جانبه با یک لوله گیرنده حاوی رقت استافیلوکوک وارد “مبادله”  شود و نه با یک لوله حاوی استرپتوکوک یا اشریشیا کلی.

این نتایج نشان می دهد که اثر انتقال توسط سیگنال های گونه های خاص میانجی گری می شود، و فرکانس هایی از آن باقی میماند که تجزیه تحلیل میشود.

در نهایت، دو مشکل دیگر در سیستم اشریشیاکلی مورد بررسی قرار گرفت: اولی نقش تعداد اولیه سلول های باکتری در القای ساختار های تولید کننده سیگنال قابل فیلتراسیون بود. به همین دلیل فاز مرحله سکون رشد اشریشیا کلی  شمارش و تنظیم شد تا به 10⁹  سلول در میلی لیتر برسد و رقت های سریالی از 100 تا100  تهیه شد تا به 1 سلول در میلی لیتر برسد. هر رقت با فیلتر  100 نانومتر فیلتر شد و سپس برای انتشار سیگنال مورد آنالیز قرار گرفت. درکمال تعجب مشاهده شد، طیفی از رقت های مثبت به طور قطع به غلظت اولیه سلول های اشریشیا کلی وابسته نبودند، و از 10⁹ سلول  تا 10 سلول تقریبا یکسان بود، پیشنهاد دهنده این مطلب است که در تمامی غلظت ها همان تعداد نهایی نانوساختارها بدست می آید. بنابراین، به طور متناقض، 10 سلول به طور مشابه همان سیگنال های 10⁹ سلول را می دهد.

همچنین باید به امکان تاثیر اپراتور در خواندن توجه داشت.

بدین منظور از دو اپراتور سالم خواسته شد مستقلا” همان رقت های اشریشیا کلی را اندازه گیری کنند هیچ یک از نتیجه دیگری اطلاع نداشت. نتایج خوانش آنها یکسان بود.

علاوه بر این، نتایج  مستقل از نظم و ترتیبی بودند که نمونه ها خوانده شدند، چه در رقت های نزولی از پایین ترین رقت به بالاترین یا در رقت های صعودی از بالاترین رقت به پایین ترین.

در نهایت یک کارگر آزمایشگاهی دیگر نمونه های رقیق شده را به صورت تصادفی در محل قرار داد، برچسب ها برای شخصی که نمونه ها را می خواند ناشناس بود. همان طیف رقت های مثبت دوباره تشخیص داده شد و برای جلوگیری از “مبادله متقابل ” هر لوله به خوبی از دیگری جدا شده بود.

همچنین مشخص شد نتایج مستقل از مکان خواندن تست است: شروع از همان نمونه فیلتر نشده اشریشیا کلی بود، رقت های مثبت فیلترشده ، در دو مکان مختلف در فرانسه ( مرکز پاریس و حومه) ،  یکی در کانادا (مونترال) و یکی در کامرون (Yaound´e) مشابه بودند.

همانطور که در شکل ها نشان داده شد، طبق زمان و مکان ثبت ، نویز  پس زمینه متغیر بود. عموما” در شهرهای بزرگ نسبت به مکان های ایزوله نویز با فرکانس بالا وجود داشت. هر چند سیگنال های مثبت  همیشه بطور وضوح توسط پیک هایی با فرکانس بالا از نویز پس زمینه قابل تشخیص بودند.

ماهیت نانو ساختارهای آبی

تیمار با RNaseA   :(خریداری شده از شرکتPromega  ، به میزان یک میکروگرم در میلی لیتر به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد) ، Dnase I (Invitrogen):  ( 10 واحد در میکروگرم DNA، 18 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد) ، Lysozyme(Fisher): (1 میلی گرم در میلی لیتر، 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد)، Proteinase K (Promega): (12/0 میلی گرم در میلی لیتر، در1٪ سدیم دودسیل سولفات، 1 ساعت در دمای 56 درجه سانتیگراد) EMS را که منجر به ایجاد فعالیت رقت های  ” loud” میشود، سرکوب نکرد و باعث فعالیت رقت های ” silent” نگردید.

با این حال، حرارت در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه ، به همان خوبی انجماد به مدت 1 ساعت در دمای منفی 20 یا منفی 60 درجه سانتیگراد، به طور برگشت ناپذیر فعالیت را مهار کرد. DMSO (10٪) ، و formamide (10٪) هیچ اثری نداشتند. تیمار با کاتیونهای لیتیوم، شناخته شده با  تاثیر بر روی  پیوند هیدروژنی مولکول های آب، قادر به کاهش شدت سیگنال ها بود،  در حالی که طیف رقت های مثبت بدون تغییر باقی ماند.
ماهیت مولکول های باکتریایی در خاستگاه  نانوساختارها:

در آزمایش های اولیه، مشاهده گردید که تیمار  مقدماتی سوسپانسیون اشریشیا کلی با فرمالدئید 1%، توانائی آن را در القاء سیگنال های الکترومغناطیسی تغییر نمی دهد، در حالی که باکتری را می کشد. به عنوان مثال در ساختار مارپیچ دو رشته ای DNAاین تیمار، بدون حمله به محتویات ژنتیکی آن، پروتئین های سطحی سلولهای باکتری را تغییر می دهد. این حالت پیشنهاد می کند که ممکن است منشاء  سیگنال ها، خود DNA باشد.

در واقع، DNA استخراج شده از سوسپانسیون باکتریایی به وسیله روش کلاسیک فنل-کلروفرم بر روی رقت های فیلتر شده و رقت های مناسب در آب قادر بود EMS مشابه با آنچه توسط باکتری دست نخورده تحت شرایط مشابه تولید میشد را منتشر کند. تیمار محلول DNA استخراج  شده با DNase  باعث از بین رفتن توانائی انتشار سیگنال ها می شود، در شرایطی که نانوساختارهائی که  قبلا” توسط DNA القاء شدند تخریب گردیدند. یک تجربه معمول به شرح زیر است:

DNA باکتری اشریشیا کلی با آنزیم پروتئیناز K در حضور SDS (سدیم دودسیل سولفات) تحت تیمار قرار گرفت و بیشتر توسط مخلوط فنل-کلروفرم دپروتئیناز شد. رسوب به دست آمده توسط رسوب گیری اتانول در تریس ^2-10 مولار، با  pH 6/7 دوباره به شکل سوسپانسیون شد و یک بخش از آن 100/1 در آب رقیق شد. رقت (^2-10) ابتدا از طریق یک فیلتر 450 نانومتری فیلتر شد و محصول فیلتر سپس دوباره با یک فیلتر 100نانومتری فیلتر شد. محصول فیلتراسیون در رقت های ده تا ده تا به صورت سریالی در آب بیشتر رقیق شد، همانطور که قبلا” توضیح داده شد.

همانطور که برای میکروارگانیسم های دست نخورده، مرحله فیلتراسیون برای تشخیص EMS در رقت های DNA ضروری بود. در غیاب آن، هیچ سیگنال در هیچ رقتی قابل تشخیص نبود.

بر خلاف سوسپانسیون میکروارگانیسمی، جائی که باور بر حفظ سلول های سالم و دست نخورده بود، فیلتراسیون با فیلتر 100 نانو متری DNA را در خود نگه نداشت و وقتی با چگالی سنجی نوری (OD ) اندازه گیری شد هنوز در مایع صاف شده بود. با این حال، فیلتراسیون با استفاده از فیلتر 20 نانو متر واتمن نانوساختارهای منتشر کننده EMS را حفظ کرد، این موضوع پیشنهاد می کند که آنها(نانوساختار ها) همان سایزهای مشابه باکتری دست نخورده مبداشان را دارند.

در مورد DNA،  نقش فیلتراسیون با 100 فیلترهای نانومتری احتمالا” درجداسازی شبکه نانوساختارهای سازمان یافته در یک کریستال مایع ژل مانند در غلظت های بالا در آب، می باشد، که باعث پراکندگی نانوساختارها(آنها) در رقت های بعدی می شود. همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است، رقت های مثبت برای EMS به طور کلی بین^7-10 تا ^13-10 و در همان محدوده ای است که برای باکتری دست نخورده مشاهده شد.Top of Form

Bottom of Form

شکل 7:  اثرDNase  روی تولید EMS . محلول DNA باکتری اشریشیا کلی تیمار شده  باDNase  و  DNAتیمار نشده از D-2  تا D-15  رقیق شد. همانطور که در شکل 5 آنالیزEMS  توضیح داده شد رقتD-2  ( برای EMS منفی) به عنوان کنترل نشان داده شده است.D-9  برای EMS مثبت ( از طیف وسیعی از رقت های مثبت D-8  تاD-11 ). به ناپدید شدن سیگنال در DNA  تیمار شده با DNase توجه داشته باشید.

محاسبات نشان می دهد که در رقت بالای ^13-10، هیچ مولکول DNA  با وزن مولکولی بزرگتر از 10⁵ در محلول وجود ندارد، با توجه به این امر بعید است  تولید EMS   بطور مستقیم توسط خود DNA  صورت گیرد، بلکه بیشتر توسط نانوساختارهای خود پایدار که با  DNA القاء شده، تولید می شود.

به طور کلی، تمام گونه های باکتری نشان دادند که مولدEMS  هستند همچنین آماده سازیDNA  برایEMS  نیز در آنها مثبت میباشد. تظاهرات بیشتر این مطلب کهEMS  تولید شده از باکتری ازDNA  آنها حاصل می شود با ناپدید شدن EMS پس از تیمار DNA با  DNaseنشان داده می شود.

با این حال این غیر فعال سازی تنها زمانی کامل بود که نانوساختارهائی که قبلا” به طور کامل تخریب شده بودند مقاومت خود را در برابر DNase ، در محلول DNA القا کردند.

این تخریب یا با انجماد محلول DNA در منفی 20 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و یا با حرارت دادن آن در 90 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه به دست آمد.

با سرد شدن  آهسته DNA  به DNA گرم شده  اجازه داده میشود تا دوباره سرد شود.  1DNase  در غلظت نهایی  10 واحد در میکروگرم از DNA اضافه شده و مخلوط در 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 ساعت در حضور 5 میلی مولار MgCl2  انکوبه شد.
یک تقسیم از محلول DNA تیمار نشده به عنوان کنترل مثبت نگه داشته شد.

در هیچ رقتی از محلول تیمار شده با DNase  انتشار EMS بهیچ وجه یافت نشد(شکل 7). تیمارمحلول DNA توسط آنزیم محدود کننده که در بسیاری از جایگاههای DNA اشریشیا کلی (EcoRV) عمل میکند تولید EMS را متوقف نکرد، و نشان می دهد که این انتشار به ترادف های نسبتا کوتاه و یا به سکانس های نادر وابسته است.

ماهیت سکانس های DNA در منشاء EMS

بررسی غیر جامعی از گونه های باکتریایی و  DNA آنها با توانائی نمایشEMS  نشان می دهد که بسیاری از باکتری های بیماری زا برای انسان در این گروه قرار دارند  در مقابل، باکتری “خوب” پروبیوتیک مثل لاکتوباسیلوس و DNA آنها برای انتشار EMS  منفی هستند.

در مورد اشریشیا کلی، ما متوجه شدیم که برخی از سویه های مورد استفاده برای حمل پلاسمیدها برای ژن کلونینگ نیز منفی بودند( شکل 8).

این نشان می دهد که تنها برخی از سکانس های DNA  با منشاءEMS  هستند.

نظر به این که بیماری زایی ( پاتوژنیسیتی) اغلب با استعداد میکروارگانیسم به اتصال به سلول های یوکاریوتی، به ویژه سلولهای مخاطی وابسته است، ما آنالیز خود را دوباره روی مایکوپلاسما پیروم متمرکز کردیم، جائی که یک ژن منفرد( adhesin  : پروتئین 126 کیلو دالتونی) مسئول چسبندگی مایکوپلاسما به سلول های انسانی است.

شکل 8: EMS  تولید شده توسط قطعه 1.5 KB  از DNA adhesin مایکو پلاسما پیروم . DNA پلاسمید حاوی قطعه 1.5 Kb  برای تبدیل یک وکتور اشریشیا کلی، XL1blue  استفاده شد. کل DNA  استخراج شد و برای آنالیز EMS رقیق شد. چپ:  نویز پس زمینه کنترل یک رقت منفی (D-2) . راست: سیگنال مثبت در D-10  (طیفی از D-9 تاD-12  ) پایین: به عدم وجود EMS  تولید شده توسط DNA استخراج شده از استرین تبدیل شده توسط پلاسمید  به تنهایی توجه داشته باشید.

این ژن قبلا” در آزمایشگاه ما کلون و سکانس شده بود (تام و همکاران، 1994 ) . این DNA کلون شده به عنوان دو قطعه در دو پلاسمید به ترتیب متناظر با N ترمینال (1.5 KBP) و C ترمینال (5 KBP)  پروتئین وجود داشت.
دو پلاسمید (pBluescript SK, Stratagene ) ، حاوی قطعات DNA در یک سویه باکتری اشریشیا کلی XL1blue  تکثیر شدند.

DNA  سویه اشریشیا کلی (با یا بدون پلاسمید) به تنهایی در هیچ رقتی  EMSنداشت.

در مقابل وقتی سویه مورد نظر با هر یک از دو پلاسمید  که حامل قطعه ژن adhesinبودند ترنس فرم گردید، EMS  تولید شد (شکل 8).

دو قطعه DNA adhesin سپس با آنزیم های رستریکشن مشخص بریده شد (N ترمینال: kbp/SpeI- EcoRI 1.5) (C ترمینال: kbp/HindIII-XbaI 5) و توسط الکتروفورز در ژل آگارز 8/0درصد جدا شد. هر قطعه DNA قادر به القاء EMS  بود (نمایش داده نشد).

ما همچنین بخش بزرگی از DNA adhesin را از کلDNA  ژنومی مایکوپلاسما با استفاده از پرایمرهای خاص و امپلیفیکیشن  به روش PCR  تخلیص کردیم.

باز هم این قطعه  EMS را القا کرد، نتیجه نشان می دهد که  آلودگی DNA  حاصل از پلاسمید که   توسط باکتری E.Coli  حمل می شود وجود نداشته است.

بحث

ویژگی جدیدی از DNA   کشف شده است و آن توانائی برخی سکانس ها برای انتشار امواج الکترو مغناطیسی در رزونانس پس از تحریک توسط محیط پس زمینه الکترومغناطیسی است.

با توجه به پایین بودن حساسیت و ویژگی در دریافت و آنالیز سیگنال، فرکانس های منتشره صرفنظر از گونه باکتری درگیر، همه یکسان هستند.

به هر حال، با تصحیح در آنالیز و حذف تنوع سیگنال های محرک، آزمایش های انتقال اطلاعات از طریق لوله های پلاستیکی نشان می دهد که ممکن است تفاوت های خاص بین گونه ها و حتی بین سکانس ها را تشخیص دهیم. در واقع، این خاصیت ممکن است ویژگی عمومی به اشتراک گذاشته شده توسط تمام DNA  های دو رشته ای مارپیچ، از جمله DNA  انسان باشد.

با توجه به شرایط موجود، به نظر می رسد تشخیص تنها با سکانس های باکتریایی خاص همراه باشد.

آنچه باقی می ماند بررسی این موضوع است که آیا آنها به برخی ژن های دخیل در بیماری ها محدود می شوند یا خیر

آزمایشاتی که از هر جای دیگر گزارش شده در واقع نشان می دهد که این تشخیص در مقیاس بدن انسان نیز به کار می رود: ما همان EMS  را در پلاسما و در DNA  استخراج شده از پلاسمای بیماران مبتلا به آلزایمر، بیماری پارکینسون، بیماری MS و آرتریت روماتوئید تشخیص داده ایم. این نشان می دهد که عفونت های باکتریایی در این بیماری ها نقش دارند.

علاوه بر این EMS را می توان از RNA ویروسها ، مانند HIV ، ویروس انفلوانزا A ، ویروس هپاتیت C نیز تشخیص داد. در این موارد، فیلتراسیون بهینه برای تشخیص EMS ، ابتدا به فیلتر اسیون با فیلتر های 20 نانومتری نیاز دارد، که نشان می دهد نانوساختارهای تولید  شده توسط RNA ویروسها از نانو ساختار های تولید شده  توسط DNA  باکتریایی کوچکتر است.

در بیماران با عفونت HIV،EMS بیشتر در بیماران تحت درمان با داروهای ضد ویروسی و داشتن بار ویروسی خیلی پایین در پلاسما، می تواند شناسایی شود. چنین نانوساختارها ی ماندگار در پلاسما ممکن است به مخزن ویروسی که از درمان ضد ویروسی فرار می کند کمک کند ، از این همکاری این فرضیه به دست می آید که آنها حاوی اطلاعات ژنتیکی ویروس می باشند.

ماهیت فیزیکی نانوساختارهائی که رزونانس EMS  را پشتیبانی می کنند، مشخص نشده است.

مطالعات بسیار اولیه بر اساس انکسار اشعه ایکسDNA ، نشان داده که  مولکول های آب شدیدا” با مارپیچ دوگانه مرتبط هستند و هر مبتدی در زیست شناسی مولکولی می داند که DNA  در محلول آب، ژلهائی مرتبط با تعداد زیادی از مولکول های آب را تشکیل می دهد.

علاوه بر این، تعدادی مطالعات فیزیکی گزارش کرده اند که مولکول های آب می توانند پلیمر طویل دو قطبی همراه با پیوند های هیدروژنی تشکیل دهند(2004 Ruan et, al, ؛ Wernet, et al ).

هرچند به نظر می رسد عمر این پیوند ها بسیار کوتاه باشد (2005 ،  (Cowan et al،  آیا همانطور که قبلا” توسطPreparata, Del Guidice و Vitielo (1988) مطرح شده، به واسطه انتشار تشعشعات الکترومغناطیسی شان، می توانند زندگی طولانی و خود پایداری داشته باشند؟

پس از اینکه ( در جعبه های مومتال) رقتها دور از دسترس محرک های پس زمینه قرار گرفتند کاهش توانایی آنها در انتشار EMS طی زمان مطالعه شده است. این توانائی حداقل چند ساعت، گاهی تا 48 ساعت طول می کشد، که نشان دهنده ثبات نسبی نانوساختارها می باشد.

آیا سکانس های آخر DNA که به حد کافی ویژه هستند، قادر به حمل برخی از اطلاعات ژنتیکی هستند؟

اگر چنین است، نقش آنها در بیماریزایی، به ویژه در پیدایش بیماری های مزمن چیست؟

مطالعات بیشتر شامل همکاری نزدیک بین فیزیکدانان و زیست شناسان برای رفع این مشکلات به وضوح مورد نیاز است.

تشکر و قدردانی

از دکتر A. Blanchard  برای اهدایDNA  مایکوپلاسما پیروم و دکتر D. Guillonnet، Olivier  R. ، L. Thibodeau و J. Varon   برای بحث مفید تشکر می کنیم.

References

[1]  Benveniste,  J., Jurgens, P., A¨ıssa, J. 1996.  Digital recording/ transmission of the cholinergic signal. Faseb Journal  10, A1479.

[2]  Benveniste, J., Guillonnet, D. 2003. Method,  system and device for producing signals from a substance bi- ological and/or chemical activity. US Patent N◦  6 541,978 B1.

[3]  Cowan, M.L., Bruner, B.D.,  Huse, N., Dwyer, J.R., Chugh, B., Nibbering, E.T., Elsaesser, T., Miller, R.J.2005. Ultrafast memory loss and energy redistribution in the hydrogen bond network of liquid H2 O. Nature 434, 199–202.

[4] David,  J. 1998. Introduction  to Magnetism and Magnetic Materials. CRC Press. 354.

[5] Del Guidice, E., Preparata, G., Vitielo, G. 1988. Water as a free electric dipole laser. Physical Review Letters 61, 1085–1088.

[6] Grau, O.,  Kovacic, R., Griffais, R., Montagnier, L.1993. Development  of a selective and sensitive polymerase chain reaction assay for the detection of Mycoplasma  pirum.  FEMS Microbiology Letters 106, 327–334.

[7] Ruan, C.Y., Lobastov, V.A., Vigliotti, F., Chen, S., Zewall, A.H. 2004. Ultrafast electron crystallography of interfacial water. Science 304, 80–84.

[8] Tham, T.N., Ferris, S., Bahraoui, E., Canarelli, S., Montagnier, L., Blanchard, A. 1994. Molecular characterization of the P1-like adhesin gene from Mycoplasma pirum. Journal of Bacteriology, 781–788.

[9] Tully, J.G., Whitcomb, R.G., Clark, H.F., Williamson, D.L. 1977. Pathogenic mycoplasmas:  cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science 195, 892–894.

[10] Wernet, P., Nordlund, D., Bergmann, U., Caval- leri, M., Odelius, M., Ogasawara, H., N¨aslund, L.A., Hirsch, T.K., Ojam¨ae, L., Glatzel, P., Pettersson, L.G., Nilsson, A. 2004. The structure of the first coordination shell in liquid water. Science 304, 995–999.